免疫密度梯度离心分离PBMC

所需试剂

操作流程

Septube-15密度梯度离心管（PBM,#601115）

Septube-50密度梯度离心管（PBM,#601150）

Lymphoprep淋巴细胞分离液（PBM，#1114546）

1.将淋巴细胞分离液通过隔板中心的孔注入 SepTube管。 注入分离液的体积请参考下表。

Septube™密度梯度离心管

2. 抗凝血用等体积 D-PBS 稀释，混合均匀。如：5 mL 抗凝 血用 5 mL D-PBS 稀释。 

3. 保持 SepTube管垂直，通过血清移液管将稀释的样品沿 管壁加入管中。样品将会和隔板上方的分离液混合，但不会影响分离效果。 

注：样品也可以直接倒入 SepTube^®管中，但要小心避免样品通过隔 板中央的小孔直接进入隔板下方的分离液中。

4. 在开启离心机制动器的情况下，室温 1200×g 离心 10 分钟。

注：如果样品在体外超过 24h 以上，建议离心 20 分钟以上。离心力（g）和转速（rpm）转换公式：

注：rpm：每分钟转速；RCF：相对离心力；Radius：离心机转子半 径（cm）

5. 离心完成后，可以将最上层不含细胞的 D-PBS 稀释液吸出弃掉，或者直接将包含 MNCs 的上层稀释液直接倒入新的无菌离心管中。请勿倒置 SepTube^®管超过 2 秒，以免底层红细胞倒出。

注：离心后，SepTube®隔板上表面可能存在少量红细胞，但这些少量的红细胞不会影响下游实验和细胞分离效果。如果 SepTube^®隔板上表面发现有较多的红细胞，可能是由于采血时间较长引起的，此时可以继续 1200×g 离心 10 分钟，以减少红细胞的残留。

6. 向分离的 MNCs 中添加 0.5-1 倍体积 D-PBS (2μM EDTA) + 2% FBS，室温 300×g 离心 8 分钟洗涤细胞。

注：为去除分离 MNCs 中的血小板，可以关闭离心机制动器，室温120×g 离心 10 分钟洗涤 MNCs。

CD4+CD25+ Regulatory T Cell Isolation Kit, human (MB，# 130-091-301) 

ImunoSep^TM Buffer (500 mL)（Novo，#604050）

LD Columns, 1 for 1×108 labeled cells (MB，# 130-042-901)

MS Columns, 2× per isolation (MB，# 130-042-201)

MidiMACS™ Separator (Separator for LD Column), (MB，# 130-042-302)

MiniMACS™ Separator (Separator for MS Column), (MB，# 130-042-102)

MACS MultiStand (MB，# 130-042-303)

(Optional) Pre-Separation Filters, 30 µm (MB，# 130-041-407) 

磁珠标记非CD4⁺细胞

注意：

所有下列步骤，非CD4T细胞的磁性标记和去除，CD25细胞的磁性标记和分选，都是使用人CD4⁺CD25⁺Treg分选试剂盒进行。使用人CD4⁺CD25⁺Treg分选试剂盒从全血样本中可同时分选Treg和Tresp 细胞。Treg细胞(CD4⁺CD25⁺) 是最后的阳选部分，而Tresp细胞(CD4⁺CD25^-) 是最后阴选的部分。

下面给出的磁性标记的细胞多达 1×10⁷。 当起始细胞少于 1×10⁷ ，用相同的体积。当起始细胞更多，有根据的调整实际体积和总体积。 (例如.,对于 2×10⁷ 细胞，使用试剂的体积和总体积都是原来的2倍）。

1. 含3%乙酸的亚甲基蓝进行有核细胞计数（见：http://www.nwbiotec.com/index.php?g=&m=article&a=new_nav_list&newid=267）。

2. 300 x g离心10分钟，弃上清。

3. 重悬至1 x 10⁷细胞/90µL缓冲液。

4. 每1 x 10⁷细胞中加入10 µL 生物素标记的CD4⁺T 细胞抗体混合物。

5. 混匀，2-8℃孵育5分钟。

6. 每1 x 10⁷细胞中加入20 µL抗生物素磁珠。

7. 混匀，2-8℃孵育10分钟。

8. 用缓冲液将反应体积调整到500µL。

磁性去除非CD4⁺T细胞

• 去除非CD4⁺T细胞是Treg分选的第一步。这一步，需要LD分选柱，可处理1×10⁸标记细胞和 5×10⁸总细胞。

• 当使用 人CD4⁺CD25⁺reg分选试剂盒时，如果用LD柱子分选，不推荐处理1.3×10⁸总细胞量。当超过这个数量，强烈推荐分开几个样本来做

1.将LD分选柱置于Midi分选器。

2.用2 mL缓冲液润洗分选柱，直到柱子中的润洗也全部流出再进行下一步。

3. 将细胞悬液加入分选柱。

4. 收集通过分选柱的细胞。

5. 用2 x 1 mL缓冲液清洗分选柱。收集所有的馏分并与步骤4的细胞混合。混合后的细胞即为预富集的CD4⁺细胞。

6.计数细胞（见：http://www.nwbiotec.com/index.php?g=&m=article&a=new_nav_list&newid=267）。

磁性标记CD25⁺细胞

1. 300 xg离心细胞10分钟，去掉上清。

2. 将细胞重悬至1 x 10⁷细胞/90µL。

3. 每1 x 10⁷细胞中加入10 µL CD25磁珠。

4. 混匀，2-8℃孵育15分钟。

5. 通过添加1-2mL缓冲液和300 x g离心10分钟，清洗细胞。

6. 将细胞重悬至1 x 10⁸细胞/500µL。

磁性分选CD25⁺细胞

注意：

Treg分选的第二步是正选CD25⁺细胞。这一步，需要2根MS柱，容纳1×10⁷ 标记的细胞。不要超过柱子容量，推荐分选之前流式分析悬液中CD25⁺的含量。

1. 将MS分选柱置于Mini分选器.

2. 用500µL缓冲液润洗分选柱。

3. 将细胞悬液加入分选柱。

4. 收集通过分选柱的细胞。

5. 用3 x 500µL缓冲液清洗分选柱。收集通过分选柱的未经标记的细胞，并与来自步骤4的细胞混合。

6. 拿出分选柱将其置于一支细胞收集管上。

7. 分选柱中加入1 mL缓冲液，迅速推动分选柱活塞，洗脱磁性标记的细胞

8. 为了提高CD4⁺CD25⁺细胞的纯度，洗脱部分可以在第二个MS柱上再次富集。

CD4 Monoclonal Antibody (RPA-T4), FITC（ eBioscience，#11-0049-42）

CD25 Monoclonal Antibody (BC96), PE（eBioscience™，#12-0259-41）

流式缓冲液（eBioscience，#00-4222-26）

5 mL流式管 (12×75 mm)（corning, #352058）

为了检测分选的Treg和Tresp细胞的纯度，通过流式检测最终的正选（Treg）和阴选部分（Tresp）。推荐分析起始样本（即PBMC分离后的样本）。

下面给出的磁性标记的细胞多达 1×10⁷。 当起始细胞少于 1×10⁷ ，用相同的体积。当起始细胞更多，有根据的调整实际体积和总体积。 (例如.,对于 2×10⁷ 细胞，使用试剂的体积和总体积都是原来的2倍）。

免疫荧光染色

1.制备单细胞悬液。

1. [可选]染色前，将细胞用10 µL纯化的人Fc受体结合抑制剂/50 µL细胞 2-25°C预孵育10-20分钟。

2. 每个管中加入等量的50 µL细胞悬液（10⁵-10⁸个细胞）

3. 将CD4和CD25抗体各5 μL在40 µL的流式细胞术染色液中进行混合并加入到细胞中，使最终的染色体积为100 µL（即50 µL细胞样品 + 50 µL混合好的抗体混合物）。 轻轻地涡旋混合。

4. 2-8°C或冰上孵育30分钟以上。避光。

5. 加入流式细胞术染色液洗涤细胞。对于微量滴定板，使用2 mL/管或200 µL/孔。 在室温下400-600 x g离心5分钟。 弃上清。通常保留约100 μL残余体积。

6. 重复步骤5。

7. 将染色细胞重悬于适当体积的流式细胞术染色液中。

8. 通过流式细胞术分析样品。

TexMACS GMP Medium（MB，#170-076-307)

Human AB Serum（PBM，#900140）

β-Mercaptoethanol (β-ME)

Penicillin/streptamycin (PenStrep)（BI，#03-031-1B）

(Optional) Rapamycin （biogems,#5318893）

Treg Expansion Kit, human: 2 mL for stimulation of 1×107 Treg cells (MB，# 130-095-345)

96-well round-bottom plate

(Optional) 24-well plate 

（可选）MACSiMAG™ Separator (MB，# 130-092-168) 

准备Treg扩增培养基

无菌4℃条件下，培养基可以储存10天。

500 mL TexMACS™ Medium
+ 500 IU/mL Human IL-2 IS, premium grade
+ 5% human AB Serum
+ 0.01 mM β-ME
+ 1% PenStrep
+ (Optional) 100 nmol/L rapamycin

该Treg扩增试剂盒是基于预负载CD3和CD28抗体的Macsibead™颗粒。 最佳的Treg细胞扩增通过Macsibead颗粒和Treg细胞4：1实现。

准备Treg细胞

1. 确定细胞浓度和Treg总量。

2. 5-10倍体积的培养基加入细胞，300x g离心10分钟，弃上清。

3. 用培养基将细胞重悬至1×10⁶ 细胞/mL ，吸取100 μL细胞悬液加入96孔板的1孔。

准备CD3/CD28 MACSiBead 颗粒

注意：

• 彻底重悬负载的抗生物素MACS微珠颗粒至2×10⁷珠子/mL。使用功能时珠子：细胞=4:1。

• MACS微珠颗粒的尺寸比MACS磁珠大，因此沉降速度快。 因此，在使用之前，必须通过涡旋使MACSibead颗粒处于悬浮状态。

1.彻底涡旋MACS微珠颗粒并在合适的管中加入4倍量细胞体积的微珠颗粒(例如，用于扩增1×10⁶个Treg细胞，转移4×10⁶(=200µL)的MACSsibead颗粒)，彻底悬浮CD3/CD28 Macsibead颗粒。

2. 加入300~600μL培养基，在300×g下离心5分钟，清洗Macsibead颗粒。 弃上清。

3.在扩增培养基中悬浮CD3/CD28MACSibead颗粒，最终浓度为2×10⁷珠子/mL(例如，4×10⁶Macsibead颗粒时，悬浮在200µL扩增培养基中)。

Treg细胞与MACSibead颗粒共培养

1.在含有Treg细胞的每孔中加入20μL CD3/CD28 MACSibead颗粒。 由于MACSibead颗粒沉降迅速，颗粒悬浮液应在加入培养孔前不时涡旋。

2.现在，每个培养孔的最终体积是120µL。Treg细胞和MACSibead颗粒在37℃、5-7%CO₂下孵育一天。

扩增过程

1. 第1天，每孔添加100μL培养基。

2. 在第3-5天（根据培养基的使用情况（颜色）），按1:2比例分配细胞或者用200µL新鲜培养基重悬细胞或吸出100µL培养基，加入100μL含500 U/mL IL-2的新鲜培养基。

3. 在第5-8天，将Treg细胞以更大体积（5×10⁵ Treg/ 500 µL）转移到24孔培养板中，或在96孔板以1:2比例进行分配或者用200µL新鲜培养基重悬细胞。

4. 第14天，计数细胞并进行下游实验。至此Treg扩增过程可以停止，也可以通过重新刺激Treg细胞来进行。 如果在这里停止Treg的扩增，可通过进行表面和细胞内染色评估扩增的结果来确定FoxP3表达细胞的总细胞数和频率。  如果想继续刺激，CD3/CD28MACSi珠颗粒可以在重新刺激之前被移除。 有关详细信息，请参阅“Treg细胞的再刺激”。

去除MACS微珠颗粒

1. 将相同处理条件处理的培养孔中的细胞收集在一起。用冷的分选缓冲液冲洗空培养孔，冲洗培养板上残留的细胞。

2. 细胞计数，并用分选缓冲液重悬细胞至2×107细胞/mL。

3. 将管子置于磁极中。

4. 使MACS微珠颗粒吸附在管壁。

5 mL 管子： 2分钟
15 mL或者 50 mL管子: 4 分钟

5. 将管子仍然置于MACSiMAG 磁极中, 小心移出细胞悬液，转移至新管。

6. 将管从磁极中拿下来，加入与先前一样多的缓冲液

7. 涡旋样本，将管子置于MACSiMAG 分选器并重复步骤4-5。

8. 收集到的细胞可用于下游研究。

(A) MACSiMAG Separator with tube rack positioned for tubes of 5 mL or 0.5 mL in size. (B) MACSiMAG Separator with tube rack positioned for tubes of 1.5 mL or 5 mL in size. (C) MACSiMAG Separator with 15 mL and 50 mL tube.

Treg细胞再刺激

注意：为了分析T细胞激活，收集刺激48小时的样本并染色早期活化标记CD25和CD69，检测活化的细胞在CD3⁺细胞中的比例。

注意：一定程度上，高度活化的T细胞会下调CD3的表达。或者，CD4和CD8染色(例如，带有CD4-VioBlue和CD8-VioGreen)可用于在T细胞亚群的刚刚弄好设门。

• MACSiBead ：细胞= 4:1.

• 根据Treg的数量和相应的体积，再刺激可以在96孔板或24孔板中进行。 如果在96孔板中再刺激Treg细胞，请参考“Treg细胞的体外扩增”并遵循该方案。 或者，还可以在更大体积的24孔板中进行再刺激，例如，在500 μL的扩增培养基中有5×10⁵Treg细胞和100μLCD3/CD28MACSibead颗粒（=2×10⁶个颗粒）

1. 第15天: 再刺激时，96孔培养板，每孔加入100 µL完全扩增培养基；24孔培养板每孔加入500 µL 完全扩增培养基。

2. 第17-19天（根据培养基的使用情况（颜色）），按1:2比例分配细胞，每孔加入1 mL完全培养基或者吸出500µL培养基，再加入500μL新鲜的完全培养基。

3. 第21天：21天后，Treg的扩增应该停止。为了评估扩增的结果、确定细胞总量、表达FoxP3细胞，可通过细胞表面和细胞内流式染色进行。

TexMACS GMP Medium（MB，#170-076-307)

Human AB Serum（PBM，#900140）

Penicillin/streptamycin (PenStrep)（BI，#03-031-1B）

Treg Suppression Inspector, human (# 130-092-909), for stimulation of 5×107 total cells

96-well flat-bottom plate

CFSE（eBioscience,#65-0850-84） 或者

CellTrace™ Violet Cell Proliferation Kit, for flow cytometry（invitrogen ,#C34571）

• 该实验流程使用 MACSiBead™：细胞=1:1进行刺激。

• 对于体外抑制实验，是Treg细胞、Tresp细胞以及Treg Suppression Inspector (含 MACSiBead颗粒) 以不同的比例共培养。为了提高最终的流式分辨率，可以相应地扩大细胞数(即每个培养孔2×10⁵Tresp细胞，相应地扩大Treg细胞和MACSibead颗粒)。 

96孔培养板的每孔中Treg细胞、Tresp细胞和TregSuppression Inspector(含MACSibead颗粒)的数量

荧光标记Tresp细胞

注意：

为了在体外抑制试验中监测Tresp细胞的增殖，细胞必须用荧光染料染色，这可以跟踪细胞的分裂，例如使用CellTrace™ Violet Cell Proliferation KIT或者CFSE。 有关更多信息，请参阅制造商的指示。本应用方案中显示的数据是用细胞追踪紫细胞增殖试剂盒获得的。

准备细胞

1. 计数Treg 和Tresp 细胞。对于一种检测，如上表中所述，需要9×10⁵Tresp细胞和6×10⁵Tregs（如果用较高的细胞数进行抑制试验，则相应地扩大细胞数）。

2. 将所需细胞数的细胞悬液转移到合适的管中。 

3. 在细胞中加入5-10倍体积的抑制培养基，300×g离心10分钟。 完全吸出上清液

4. 用1800μL抑制培养基重悬Tresp细胞（9×10⁵），用1200μL抑制培养基重悬Treg细胞(6×10⁵）。

注意：两种细胞悬液的浓度现在为5×10⁵细胞/mL。

5. 吸取适当体积的Treg和Tresp细胞悬浮液在96孔培养板。 请参考“准备Treg Suppression Inspector，人”中的表格，以获得相应的体积。

Tresp:Treg

Tresp
(5×10⁵ cells/mL)

孵育

抑制检测在 37 °C，5–7% CO₂孵育5天。

免疫荧光染色

1. 将每个培养孔中的细胞悬液转移到5mL分离管中，收集细胞。

2. 每1×10⁷ 细胞用1-2mL分离液洗涤， 4 °C， 300×g离心10分钟。弃上清。

3. 用50 μL缓冲液重悬细胞。

4. 加入CD4和 CD25荧光抗体各5 μL。

5. 加入40μL缓冲液。

6. 混合均匀，2–8 °C避光孵育10分钟。

7. 每1×10⁷ 细胞用1-2mL分离液洗涤， 4 °C， 300×g离心10分钟。弃上清。

8. 重悬细胞在合适的体积用于下游流式分析。