内胚层和前肠球体的定向分化（步骤11-14）

第9-12d：4d确定内胚层分化，4-5d前肠内胚层分化

11.在开启动流程之前，细胞45-75%融合时传代。 这可能需要在传代1-2天后。

12.添加定型内胚层培养基4天。（ 每天，通过移除现有培养基并将其替换为新鲜培养基，24孔板每孔0.5mL）。

13.培养的第5天，用前肠内胚层定向分化培养基替换现有培养基。第6、7、8和9天更换培养基。在第5-9天，每天更换培养基。

14.在第8天和第9天左右开始形成漂浮的球体。

收集漂浮的前肠球体（步骤15-19）

15-60分钟

15. 在第8或第9天，将Matrigel（货号#354234）放在冰上的无菌安全柜。

16. 用无菌剪刀或手术刀切掉无菌p200移液管尖端大约5 mm，并将一支空的1.5mL带管盖的管子和一个新的（未包被的）24孔板放入有解剖显微镜的生物安全柜中。

17.将含有前肠球体的24孔培养板放置在解剖显微镜下。 在显微镜下观察以识别自由漂浮的球体。不要扰动单层，用一支切掉管尖的的p200吸管，轻轻地吸取自由浮动球体，将它们转移到一个空的1.5带盖管中。 多个培养孔的球体可以汇集在一支管子里。 通常将一个完整的24孔板汇集成一个1.5mL管。允许5-10分钟的球体沉降。尽管球体应该在重力作用下沉降下来，但是如果有必要可以在微离心机中低速离心10秒。

18.将球体接种于Matrigel胶(8.0mg/mL蛋白浓度)。 为了做到这一点，使用新鲜的p200，在解剖显微镜下轻轻地从管子中取出尽可能多的培养基。一旦移除培养基，立刻将一新的P200移液管管尖减掉。吸取200µLMatrigel。将Matrigel与球体一起放在管中，轻轻地上下吹打几次，将Matrigel与球体混合。操作要快速，以防成胶。  小心操作，以防产生气泡。将25µLMatrigel和球体混合物加入24孔板的单个培养孔中心。 200µL的起始混合物将足以使8个单独的培养孔均形成一个包含球体的Matrigel液滴。

19.将培养板放入培养箱10分钟，使Matrigel液滴凝固。一旦液滴凝固，加入0.5mL的所需培养基，从而产生人肺类器官或上皮芽尖祖细胞类器官。

形成人肺来器官（步骤20A）

50天

20A.维持培养人肺类器官

具有周围被间质细胞包围的气道状结构需要50天生长，最佳的在第50-85天，因为这时类器官具有最大数量的气道样结构。需要每2-3周重新嵌入新鲜的Matrigel。

i. 前肠分化基础培养基中加入 1%  FBS 和500 ng/mL  FGF10。在包含球体的每孔中加入 500 µL 培养基, 确保培养基完全覆盖Matrigel液滴。每3-5天换液一次。

ii. 再次嵌入类器官。每 2–3周或者更快，如果类器官出现在腔中积累细胞碎片，或者下沉到Matrigel液滴的底部，将p1000移液管管尖切掉，并轻轻刮擦培养孔底，以解离含有类器官的Matrigel。

iii. 用吸管尖将整个液滴和周围的培养基一起吸出并转移到培养皿。在无菌环境中下解剖显微镜下，使用手术刀和27号钝针头轻轻切除并移除旧的Matrigel。小心不要切到组织。一旦完成，将现在的新的类器官转移至一支1.5mL带盖管中，并移除任何培养基。

iv. 切掉p200吸管管尖，并将200µL新鲜的Matrigel（保持在冰上）转移到含类器官的管子里；混合并将吸上所有Matrigel。连续将50µL Matrigel类器官混合物放入新鲜的24孔板的每孔中。目的是在每个液滴中植入1-3个类器官。

v. 将培养板置于培养箱10分钟，或者直到Matrigel液滴凝固。一旦液滴凝固，加入500µL 培养基。

vi. 在所需的时间内维持类器官，每2-3周重新植入类器官重复步骤20A(ii-v)。 一旦前肠球被放置在Matrigel中，大约需要50天才能获得含有基底细胞、粘液产生细胞和纤毛细胞，以及肺间充质细胞类型和原始肺泡细胞类型包围的假复层上皮结构。类器官可维持100天以上，但随着时间的推移，上皮逐渐丢失，60~85天之间是最佳的。

产生芽尖祖细胞（步骤20B）

14-120天：开始生长14d，维持和连续传代120d

20B.产生芽尖祖细胞

使用无菌针头传代，产生和维持芽尖祖细胞类器官。上皮cysts将在~2周后形成，并将包含一个几乎均质的芽尖祖细胞群体。如果培养物不均质，有明显上皮crysts结构的类器官可以在这个时间点（2周）进行手动分离。这种上皮类器官群可以通过无菌针传代培养120天来维持和扩增。

i. 使用当天，在DMEM/F12 + N-2添加物 + B27添加物+ 1× L-谷氨酰胺 + 1× 青链双抗组成的基础培养基中加入50 µg/mL L-抗坏血酸, 0.04 µL/mL monothioglycerol, 10 ng/mL FGF7, 50 nM ATRA和3 µM CHIR-99021 制成芽尖祖细胞类器官完全培养基。使用500 µL 完全培养基培养前肠球体。

ii. 每3-5天换液一次。

iii. 针头传代。在2-3周后或者更早，如果类器官在腔内出现细胞碎片积累或下沉到Matrigel液滴的底部，则使用P1000吸管尖端来去除含有类器官的Matrigel液滴。 将脱落的液滴放在一起，放入一个1.5mL带盖管中。

iv. 使用1mL注射器和27号钝针头，将Matrigel和细胞吸入注射器，并将内容物强行推回管中。 重复2-3次。

v. 在台式微型离心机中旋转管子中的内容物(例如，ThermoFisher mySPIN6微型离心机，货号# 75004061)全速（6300g）3-5秒。4℃，300g下旋转细胞3分钟也是可以接受的。上皮碎片将沉降到底部，Matrigel将继续悬浮在培养基中。

vi. 在无菌生物安全柜的解剖显微镜下，使用针头和注射器从管中取出培养基和Matrigel，留下细胞团。

vii. 用剪掉管尖的p200吸管将200µL新鲜的预冷Matrigel加入管中。混合细胞和Matrigel，避免气泡。将所有Matrigel混合物吸入，并连续将25µL的混合物加入24孔板的每孔。

viii. 将培养板置于培养箱10分钟或者知道Matrigel液滴凝固。加入750 µL芽尖祖细胞类器官完全培养基。

vx. 每2-3天按照步骤20B（iii-viii）重复针头传代，或在任何时间点挑选芽尖祖细胞群。

形成芽状、典型的肺类器官（步骤20C）

6周

20C.过通量传代获得芽尖祖细胞类器官

上皮cysts将在~2周后形成，并将包含一个几乎均质的芽尖祖细胞群体。为了产生具有离散芽尖和气道样肺类器官，在传代过程中保持其结构完整。如果不使用针头传代芽尖芽尖祖细胞类器官，培养6周后将有助于芽上皮结构和，近端-远端模式的元素的产生，以及结构内部的功能性粘液细胞产生。

注意：不通过针头传代的芽尖祖细胞类器官将分泌粘液到腔，引起致密的外观，导致细胞死亡增加；因此，这些类器官必须定期清除。

i. 使用当天，在DMEM/F12 + N-2添加物 + B27添加物+ 1× L-谷氨酰胺 + 1× 青链双抗组成的基础培养基中加入50 µg/mL L-抗坏血酸, 0.04 µL/mL monothioglycerol, 10 ng/mL FGF7, 50 nM ATRA和3 µM CHIR-99021 制成芽尖祖细胞类器官完全培养基。使用500 µL 完全培养基培养前肠球体。

ii. 每3-5天换液一次。

iii. 不用针传代芽尖类器官。在2-3周后或者更早，如果类器官在腔内出现细胞碎片积累或下沉到Matrigel液滴的底部，则使用P1000吸管尖端来去除含有类器官的Matrigel液滴，并培养基和Matrigel液滴一起转入培养皿。

iv. 使用手术刀和27号钝针头轻轻切除并移除旧的Matrigel。小心不要切到组织。按照步骤20A（ii-v）重新嵌入新的Matrigel液滴。这些类器官含有芽尖祖细胞，在类器官周围的芽尖结构中，内部区域将主要显示SOX2气道状结构，可分化谓粘液分泌细胞。这些可以按照步骤20B（iii-viii）使用针头传代，并在任何时候挑选芽尖祖细胞群。

v. 清除来自于非针头传代类器官的粘液分。粘液或细胞碎片通常会聚集在类器官的腔中，并会以光学致密、黑暗和颗粒化的形式出现  在培养物不传代的2周后。为了清除这些碎片，乣一把无菌手术刀、干净的27号钝针头、一支1mL注射器和一支新鲜分装的预热DMEM/F12。将Matrigel和类器官转移添加了余人的DMEM/F12的培养皿中，并将其转移到放了解剖显微镜的无菌生物安全柜中。

vi. 在显微镜下，用无菌手术刀将器官切成两半。 使用1mL注射器与27号钝针头，吸满干净的预热的DMEM/F12。 轻轻推出培养基冲走类器官中的粘液细胞。

基础培养基

RPMI 1640

RPMI 1640  0.2% (vol/ vol)   FBS

RPMI 1640  2% (vol/vol)   FBS

RPMI 1640  2% (vol/vol)  FBS

(前肠基础培养基)  Advanced  DMEM/F12, 1×  N-2, 1× B27, 10  mM HEPES  buffer, 1× L-glutamine (2  mM), 1×  penicillin– streptomycin  (5,000 U/mL)

(前肠基础培养基)

 Advanced  DMEM/F12, 1×  N-2, 1× B27, 10  mM HEPES  buffer, 1× L-glutamine (2  mM), 1×  penicillin– streptomycin  (5,000 U/mL)

(芽尖基础培养基)  DMEM F12, 1×  N-2, 1× B27, 1×  L-glutamine (200  mM), 1×  penicillin– streptomycin  (5,000 U/mL),  0.05% (vol/vol)  BSA

培养当天加入

Activin A,  

100 ng/mL

Activin A,  100 ng/mL

Activin A,  100 ng/mL

Activin A,  100 ng/mL 

10 µM SB431542,  200 ng/mL  Noggin, 1 µM  SAG, 500 ng/mL  FGF4, 2 µM  CHIR-99021

500 ng/mL  FGF10, 1% (vol/ vol) FBS

0.4 µM monothioglycerol, 50  µg/mL ascorbic  acid, 10 ng/mL  FGF7, 50 nM  ATRA, 3 µM  CHIR-99021