表皮细胞癌（Epidermal carcinomas），即基底细胞癌（Basal Cell Carcinomas，BCC）和鳞状细胞癌（Squamous cell carcinomas，SCC）为人类常见恶性肿瘤。与这些癌症最相关的环境因素是紫外线（Ultraviolet）辐射，紫外线B（Ultraviolet-B）可导致直接诱变（Grimbaldeston等，2006年；Hart等人，2001；Halliday和Lyons，2008年）。长期光损伤的皮肤，表皮的整个区域都受到影响，导致出现多个肿瘤区。最近研究表明暴露在阳光下的正常皮肤，会发生基因的大量突变，包括已知的癌基因通常在SCC中找到（Martincorena和Campbell，2015年），证明暴露于紫外线的表皮细胞内潜在致癌能力。但是也可能提示突变不是引发肿瘤形成的唯一必要条件，因为即使带有致癌突变，皮肤仍保持正常。

    为了更好地了解紫外线（UV）照射对皮肤癌变初期的影响，我们检查标记的角质形成细胞斑块代表小泡间表皮（Interfollicular epidermis）中的克隆，并测量在UVB照射下它们的大小变化。多色谱系示踪显示在长期照射下皮肤上，靠近毛囊（HFs）的斑块增大，而远离毛囊的斑块不变。UVB中断后，HFs附近的斑块大小显著下降。增殖细胞的解剖学差异对研究基底细胞癌（BCC）的起源细胞有重要意义。紫外线诱导鼠BCC模型显示BCC斑块在HF附近出现更频繁，更大且更具侵入性。这些发现对预防表皮癌有重要意义。

研究思路和方法

 采用UVB照射3-10周小鼠，每周3次，且每两周增加0.5分钟照射时间，取3/5/8/10周不同时间点的毛发周期阶段的休止期，收集小鼠背部皮肤样本，做免疫组织化学染色及整个外显子组测序。

实验方法

具体方法：

1、处死小鼠，剃去毛发，收集皮肤组织样品

2、在4％PFA中固定2小时。

3、固定后，将整块背部皮肤样品在4℃下透膜并封闭过夜（封闭液1xPBS +0.5% TritonX， 2% BSA，20％正常山羊血清，1% DMSO和100mM 马来酸）。

4、在4℃下孵育一抗（ rabbit anti-keratin17和rabbit anti-keratin14）24小时。

5、用1:500稀释的Alexa Fluor 647 (Invitrogen)和Alexa Fluor 568 (Invitrogen) 二抗，4℃孵育24小时。

6、将整个皮肤组织样品在 0.2 mg/ml  DAPI中复染，4℃孵育过夜。

7、在 组织透明试剂RapiClear 1.52 中透明化处理3-6小时（SunJin Lab）。

8、将样品用防淬灭封片剂封片， 用Zeiss LSM 710共聚焦显微镜扫描，3D成像。

温馨提示：

1、对于较厚组织样本的荧光染色，荧光稳定性至关重要，因此建议选用稳定且信噪比较高的荧光染料，如Alexa Fluor 及Alexa Fluor  Plus 系列染料。

2、选择一种好口碑的组织透明试剂

SunJin Lab RapiClear 是一种无毒的水溶性组织透明试剂，含有防淬灭成分，染色的透明样品可以稳定储存两年。

实验结果

显微成像显示 z 轴上的整个皮肤的 2D 光学截面，其中显示了附着或侵入HFs的典型K17 + patches（绿色）。白色虚线表示表皮和真皮之间的界限（比例尺，50mm）。

返回 RapiClear 组织透明 目录