抗体制备 目录

病毒

       病毒是由一个核酸分子 (DNA 或 RNA) 与一个保护性蛋白外壳包裹构成的非细胞形态，其借由感染进入细胞的机制，靠利用宿主的细胞系统进行自我复制进行寄生生活的介于生命体及非生命体之间的有机物种。 病毒颗粒大约是细菌大小的百分之一，多数病毒直径在 100nm(20~200nm)，较大的病毒直径为 300-450 纳米 ( nm)，较小的病毒直径仅为 18-22 纳米 ，不能被一般实验室细胞显微镜检测，需要借助电镜观察。 第一个已知的病毒是烟草花叶病毒，由马丁乌斯 ·贝杰林克于 1899 年发现并命名，迄今已有超过 5000 种类型的病毒得到鉴定 。

       病毒不仅分为植物病毒，动物病毒和细菌病毒。根据病毒基因组核酸组成及复制方式，病毒可以有如下分类：

对于进入新世纪以来，给人类社会造成多次灾难的冠状病毒，目前由如下分类组成：

  病毒的生命过程大致分为：吸附，注入（遗传物质），合成（逆转录 整合入宿主细胞 DNA ），装配（利用宿主细胞转录 RNA ，翻译蛋白质再组装），释放五个步骤。

病毒是如何在体内被清除的

       免疫系统分特异性和非特异性两个部分。对病毒的清除主要靠特异性免疫系统，比如T细胞,B细胞等免疫细胞。但是这些免疫细胞不能直接识别病毒，它们需要通讯兵抗原呈递细胞(Antigen Presenting Cells,APC)(比如树突状细胞)帮忙才能识别病毒。

      通讯兵抗原呈递细胞吞噬病毒以后，拆解撕成碎片(抗原,Antigen)分析后将情报通过APC表面的 MHCII （Major Compatibility Complex II（主要组织相容性复合物 II ))分子 告知T细胞(T Cell Receptor,TCR 受体)和B细胞(B Cell Receptor,BCR 受体)这种病毒的部分主要特征；然后这些接收情报的T细胞和B细胞采取行动扩充队伍（激活、扩增）、制造弹药（抗体、细胞因子）后，就可以去全身巡逻了，只要碰到它们认识的病毒就会立刻清除。

      病毒是没有细胞结构的微生物，不能进行自我复制和增殖，所以它只能寄生在细胞里，对于感染人的病毒，它会进入活的人体细胞里面，劫持人体细胞的物资复制自己，扩充自己的队伍，一旦将细胞内的物资耗竭掉后它们会破坏细胞逃出细胞外感染下一个细胞，继续不断复制自己，不断破坏细胞并引起炎症反应。因为这个特点病毒其实是自带逃避免疫系统属性的，第一次感染的病毒不被免疫系统识别，因为免疫系统从外表看到的是自己体内的细胞（友军）。 病毒复制的过程中会产生一些能被移到细胞表面的物质成分（抗原），或者细胞自己会发出危险信号， 通过 MHC Ⅰ分子 告知免疫系统这里有病毒敌人 （表达有 MHCII 的细胞才是抗原提呈细胞 APC ，而所有有细胞核的细胞都表达有 MHCI 。这时候 Tc 细胞就会前来识别 MHC Ⅰ传递来的情报抗原。 Tc 细胞（ Cytotoxic T Cell,CD8⁺ T Cell ，细胞毒性 T 细胞）接到情报指令后经多方信息确认后开始动员激活扩增部队，会释放穿孔素（ Perforin ）和颗粒酶 Granzyme ）杀伤受病毒感染的细胞，使得病毒不能完成复制，也就不能继续感染其它健康细胞 ，将被感染的细胞和病毒一起灭掉。

      如果抗原呈递细胞（通讯兵）APC 在病毒进入细胞之前，没有及时发现敌情抓几个病毒分析，免疫细胞（ T细胞和 B 细胞）就不能接到信号指令对病毒做出反应。一旦病毒藏到细胞内部之后就不断的变异 ，不断的改变容貌， 让之前通讯兵的情报失灵，使得免疫细胞部队不能将病毒同伙一网打尽。这也就是为什么流感病毒疫苗的成份每年都不一样的原因，当然也有比较笨的病毒变化没有那么快，所以人们很容易利用一种疫苗就把它们干掉了。如果这种病毒毒性比较强（致死）、传播比较广、变异比较快，那么将引发灾难性的疫情，如 SARS 病毒、 MERS病毒、埃博拉病毒、 2019 新型肺炎病毒等。 至于哪种病毒能导致严重疫情的爆发以及严重程度，就看病毒的突变和免疫系统谁能干掉谁了，实在不行，人类社会还有终极大招、最流氓的手段隔离、切断传染源，当然这一招人类也会大伤元气，不到万不得已不会放大招。言归正传，理论上说免疫系统清除病毒的过程中任何一个环节被破坏，只要破坏的足够彻底，就可能绕过人体免疫。基本方向就是两个，一个是让免疫系统认不出病毒，主要靠破坏抗原呈递细胞 （通讯兵）和突变变异（自我变脸)；另一个就是先下手为强直接干掉免疫一线作战部队， 破坏掉 T 细胞和 B 细胞，让免疫系统认识它也没办法。 一部分巨细胞病毒就可以破坏抗原呈递，主要是在被抗原呈递细胞抓住后，从内部破坏抗原呈递细胞的病毒呈递功能，简单说就是抗原呈递细胞变成哑巴无法通报情报了，它自己认识病毒却没办法告诉免疫系统的其它细胞。而大家熟悉的 HIV 就是先下手为强的典型，直接专干 T 细胞。

怎么预防病毒引发疫情

       病毒这东西小到看不见、摸不着，一旦发作起来防不胜防， 而且还没有特效药， 对于病毒难道人类社会除了被动应战,每次被动的重新建立免疫系统部队或者放终极大招对我们自身伤害损失比较大， 就没有其它方法了吗？非也， 我们还可以提前准备预防免疫部队，以最少的数量储备预备部队，一旦病毒来袭，养兵千日用兵一时，迅速启动部队应战，速战速决，将损失降低到最低。这个怎么办到？接种疫苗预防！

       说到疫苗，大家一般会听到关于天花疫苗的故事。天花这种古老的疾病在人类中存在了上万年， 公元 900 年代，我国就有记录利用接种技术预防天花了（Int. J. Infect. Dis. IJID Off. Publ. Int. Soc. Infect. Dis. 1998, 3,54–60.）；18世纪的欧洲也饱受天花困扰，每年因此死亡的人数超过40 万。感染天花之后的死亡率非常高，死状也很惨，在英国医生爱德华•琴纳（Edward Jenner）之前，已经有从患病的人身上取脓物接种给未患病的人、让人获得免疫力的方法。不过，这种方法风险太高，还是有可能导致死亡的。当时琴纳在英国乡间行医，当地人都知道，挤奶女工似乎不会受到天花的影响。18 世纪末琴纳就猜测，也许是女工的牛痘让她们获得了免疫力。牛痘这种病和天花类似，但是要温和得多，一般不会造成太大伤害。为了验证自己的理论，琴纳做了个实验。他从挤奶女工手上的痘痂里取了一些脓液，接种给了一名8 岁男孩。男孩发了点儿烧，但是没什么大事。而最关键的一步是，琴纳随后给男孩接种了天花，男孩并没有发病。琴纳通过这个步骤证明，接种牛痘确实能让人获得对天花的免疫力。琴纳的工作现在被认为是免疫学的基石，而天花后来也成了唯一一种被人类从地球上根除的传染病。虽然琴纳利用牛痘预防了天花，但是其中的原由直到19 世纪下半叶由法国人路易•巴斯德（Louis Pasteur）才搞明白微生物、传染病和疫苗的关系。

       疫苗是指用各类病原微生物制作的用于预防接种的生物制品。其中用细菌或螺旋体制作的疫苗亦称为菌苗。其经过人工减毒、灭活或利用转基因等方法制成，保留了病原菌刺激动物体免疫系统的特性。疫苗的作用主要是激活免疫系统，使其产生可以长期存在的记忆细胞（预防部队），在遭遇第二次感染的时候，可以立刻被唤醒动员，消灭入侵的病原微生物行使保护作用。

       疫苗一般分为两类：预防性疫苗和治疗性疫苗。预防性疫苗主要用于疾病的预防，接受者为健康个体或新生儿；治疗性疫苗主要用于患病的个体，接受者为患者。

       根据传统和习惯又可分为减毒活疫苗（live‐attenuated vaccine）、灭活疫苗（inactivated vaccine）、类毒素疫苗、亚单位疫苗（含多肽疫苗）、载体疫苗、核酸疫苗等。常用的活疫苗有卡介苗，脊髓灰质炎疫苗、麻疹疫苗、鼠疫菌苗等。常用的灭活疫苗有百日咳菌苗、伤寒菌苗、流脑菌苗、霍乱菌苗等。

1) 毒性减弱的“减活”疫苗（live‐attenuated vaccine）：含有仍然可以复制的经过弱化的生物（例如以胚芽的形式存在）：例如麻疹/腮腺炎/风疹联合疫苗、天花疫苗和水痘疫苗等；

2) 灭活疫苗（inactivated vaccine）：含有经过处理已经杀死的生物体：例如甲肝疫苗、狂犬疫苗和用于注射的流感疫苗或脊髓灰质炎（小儿麻痹症）疫苗等；

3) 亚单位疫苗：仅含可以刺激产生免疫反应的生物体部分（例如采用类毒素作为抗原）：例如乙肝疫苗、人乳头瘤病毒HPV 疫苗以及“百白破”疫苗等。

疫苗的有效性取决于疫苗的免疫原性，但是在考虑有效性的同时还要考虑机体的耐受性，一种好的疫苗要在疫苗的免疫原性和耐受性这两者之间要取得一个好的平衡（如右图）。伴随着疫苗的免疫原性（刺激免疫系统产生可以对抗病原体的细胞和抗体等）依次减弱，被接种对象对此的忍受能力则依次增强。通常来说，如果采用活体疫苗进行接种免疫，仅需1-2 次剂量就可以产生终身受用的免疫应答；而其它形式的疫苗则需要周期性地进行免疫加强 –第一次的一针不够用，此后定期地还要再补上几针。 疫苗（类似病毒的伪军）接种之后，免疫系统对此进行的一系列应答反应。以作为抗原的流感病毒疫苗为例，当经过肌肉注射进入人体之后，首先激活“先天免疫系统”/“非特异性免疫系统”（innate immunity），并由其中的通讯兵APC进行处理，这包括巨噬细胞（一种体积很大的单核白细胞，可以吞噬抗原体或其它颗粒物质）以及树突细胞（这种细胞长得很像神经细胞的树突，它的作用对于连接先天和后天免疫系统的至关重要）。另外，巨噬细胞可以产生一些炎症分子，这也是为何在注射疫苗之后会出现局部反应的重要原因之一。

此后抗原物质或者携带抗原的树突细胞进入淋巴结，在此通讯兵APC将情报传给作战部队，即可以激活免疫系统中至关重要的两类细胞（作战部队）：一类是可以产生抗体（也被称为免疫球蛋白，可以结合并且中和细菌和病毒等病原体）的B细胞，另一类是行使其它不同免疫功能效应的T细胞。请注意，如果抗原物质是此前免疫系统未曾接触过的，或者是由于自身的变化而产生的新型种类，那么免疫系统对此进行应答是由“原始B细胞”以及“原始T细胞”完成的。由此而来，可以产生一些对于该特定抗原具有记忆力的B细胞（其中包括可以长期存活，并且在激活后，产生大量抗体的浆细胞）和T细胞（预防部队），存在于骨髓之中（如右图）。激活免疫系统并且导致骨髓产生这些记忆细胞，并且使其可以在身体需要的时候“挺身而出”，也就是接种疫苗（伪军）的根本目的。

       在实际接种疫苗的过程中，由于病原体的变异以及记忆性细胞（预防部队）的衰老和凋亡，需要在不同的时间点接种多次疫苗以加强和巩固疫苗的预防效果，详细信息可参考专业文献，在此不再详述。说了这么多，因为病毒（敌人）太狡猾，老是变身，防不胜防，不管是疫苗还是其它辅助药物，最终发挥战斗作用，消灭敌人的还是我们的免疫系统自身，所以吃什么药、打什么针都不如我们有一个好的健康身体，这个是我们一切战斗的根本物质基础保障。

疫苗是如何研制的

 疫苗对于人类抗击传染病发挥了巨大作用，其研制过程大体上遵循了巴斯德的研制流程，在此以病毒疫苗的研制为例作一般介绍。目前常规病毒型疫苗的研制主要分为四个阶段： ① 分离筛选病毒株——②大量培养扩增病毒——③疫苗安全性、有效性评估——④疫苗临床试验

1) 筛选疫苗毒株 

    首先从病毒感染者样本中分离出病毒株,然后再从分离出的病毒株中筛选出适合生产疫苗的弱毒株。研发人员挑选它的时候,必须保证它具有良好的抗原性、能很好地代表流行的病毒的抗原特征,且具有较强的生长能力,便于生产疫苗时增殖培养病毒。分离病毒前可以用实验室手段（ELISA、测序、胶体金等）先检测出含有哪些病毒再分离。 

    拿到病料之后先处理一下 如果是内脏的话需要研磨 把病料用青链霉素处理 防止细菌污染。

2) 临床前疫苗的研制 

     筛选出疫苗毒株后,研究人员首先要用鸡胚或细胞培养增殖培养病毒,建立疫苗株病毒种子库,作为日后大规模生产疫苗的种子病毒。然后利用种子病毒进行大量病毒培养、收获病毒液、进行病毒灭活、纯化、鉴定等一系列的步骤,制成病毒疫苗原液。根据需要将原液稀释、加入一定的佐剂后分装,制成供临床前评价研究的疫苗。这种第一批研制出来的、尚未进行任何安全性、有效性等评价的疫苗即是所谓的临床前疫苗。

3) 疫苗临床前安全性、有效性评估 

     在这一阶段,研究人员首先要对疫苗开展一系列的理化和生物学检测以确定疫苗的抗原含量等各项指标是否都符合疫苗的设计要求,然后通过动物试验评估疫苗的安全性和有效性。疫苗的安全性和有效性评价通常要在小白鼠、家兔或猴子等动物身上进行，即疫苗的临床前研究。

 4) 疫苗临床试验 

     疫苗临床试验研究分为三期,一期主要是通过向志愿者接种疫苗,评价疫苗的安全性;二期主要是评价疫苗的有效性,主要研究和评估接种后疫苗是否能刺激机体产生中和性保护抗体,使接种者获得免疫保护力;三期主要是评价疫情发生情况下,通过对接种人群与未接种人群患病率的比较,观察在疫情出现时疫苗对免疫接种人群的免疫保护效果和安全性。 

上述四个阶段完成后,疫苗才可以申请生产许可证。获得生产许可证之后疫苗才能大批量生产。但为了保证疫苗的万无一失,有关部门对上市后的疫苗还要进行质量监控。（参考：李文思，病毒型疫苗研制）

病毒的培养方法有动物接种、鸡胚培养、组织培养、细胞培养。

1.动物接种：

这是最原始的病毒培养方法。根据病毒种类不同，选择敏感动物及适宜接种部位。常用的动物有小鼠、大鼠、豚鼠、兔和猴等，接种的途径有鼻内、皮下、皮内、脑内、腹腔内、静脉等。病毒经注射、口服等途径进入易感动物的体内后可大量增殖，并使动物产生特定的反应。例如脑炎病毒以注射脑内最敏感。接种后经一定潜伏期，动物发病或死亡即进行解剖。根据动物的症状表现，器官病理改变，受染脏器组织悬液能在同种动物进行连续传代，并排除其他微生物污染的可能性等，即可证明有病毒的增殖。

优点是操作方面易行，缺点是受机体免疫力的影响，常需要用无菌动物。在疫苗和抗血清的生产领域常应用此种方法。

2.鸡胚培养：

鸡胚对多种病毒敏感。根据病毒种类不同，一般用9-12日龄的鸡胚，分别接种于卵黄囊内或绒毛尿囊膜上、羊膜腔，尿囊腔等部位，用于病毒分离与疫苗生产。鸡胚培养适用于流感病毒，痘病毒，疱疹病毒和脑炎病毒等的培养。

步骤：

1) 鸡胚的检查  将9~11日龄鸡胚置于检卵器上，照视观察鸡胚是否生活，根据①小血管是否清晰；②胚胎是否活动，观察小鸡的眼睛黑点是否移动。如果鸡胚不动，血管昏暗模糊，变黑或苍白都表示已死亡。  2) 接种  用铅笔标明天然气室及鸡胚位置，然后在绒毛尿囊膜发育区〈照视时呈现红色〉近胚位处的气室边缘作一记号，定为注射入口。  用碘酒消毒注射入口和天然气室端的蛋壳，再用电钻，口腔科用牙钻和小锉刀，于注射入口和天然气室端的蛋壳上锯一小孔，勿伤及卵膜。  用大头针通过火焰消毒后刺穿气室端所开小孔的卵膜，这样可避免在注射时液体回流出来。 将鸡胚横卧于蛋架上，用无菌l 毫升注射器抽取病毒液体，针头与卵壳成30°交角，由注射器小孔剌入0.5~1.0 厘米，注0.1~0.2 毫升。 注射完毕，用胶布封口，封口前胶布用碘酒消毒，并通过火焰烧去余碘，用过的注射器用煮沸法消毒，鸡胚放入35~37 ℃培养。 注射后次日，逐日观察鸡胚生活情况，孵育48～72小时后移入4℃冰箱过夜。注意鸡胚必须直立，令气室端朝上。 滴定尿囊液的病毒血凝效价。 尿囊接种法适用于某些呼吸道病毒如流感，副流感，新城鸡瘟等病毒之培养，唯分离培养不如羊膜腔接种法的阳性率高。

 3. 组织培养：

组织培养是目前培养病毒应用最广的一种培养方法，其优点是①经济适用，结果正确且敏感；②较实验动物易于控制。将离体活组织块或分散的活细胞加以培养，统称为组织培养。组织培养法有三种基本类型：器官培养、移植培养和细胞培养。 

原代细胞单层培养法是指动物（包括脊椎动物和无脊椎动物）的组织自机体取出后，经胰酶或其他细胞分散剂消化处理，得到单个细胞悬液。以一定量接种到特定容器中，加入细胞生长所必需的营养液，置合适温度中经一段时间的培养，分散的单个细胞即贴附玻壁，开始分裂增殖并逐步长成均匀致密的单层细胞。 

病毒接种及病毒对细胞致病变作用（CPE）的观察，在低倍镜下，选择生成致密成单层的细胞培养管或40 孔细胞培养板，吸去培养液；培养管每管0.1 ml（细胞培养板每孔加入0.025 ml）的新城鸡瘟病毒液，分别置37 ℃温箱或CO2培养箱中使病毒吸附30 分钟，然后吸除病毒接种物，加入维持液，每管0.7 ml 或每孔0.2 ml，（含1% 小牛血清的0.5% 水解乳蛋白Hank\s 液，其他成分同营养液）置37 ℃培养。每天取出，低倍镜下观察有无细胞病变出现（细胞变圆，堆积及脱落）。注意要与不接种病毒的细胞对照作比较。

 4. 细胞培养 

细胞培养最常用于培养病毒，根据细胞的来源，染色体特性及传代次数又可分为下列类型：原代和次代细胞培养，二倍体细胞株和传代细胞系。病毒感染细胞后，大多数引起细胞病变，称为病毒的致细胞病变作用。表现为细胞变形，胞浆内出现颗粒化，核浓缩、核裂解等。 

从人及动物某些组织，特别是肿瘤组织，经多次传代可建立传代细胞系，这种细胞能无限地传代，某些传代细胞对病毒敏感范围较广，可用作病毒的分离鉴定，如HeLa：细胞来自子宫颈癌，Hep-2：细胞来自喉癌而KB：细胞来自上颚癌。由于这几种传代细胞有致肿瘤作用，目前仅用做病毒的分离鉴定及一些病毒学研究，不能用于疫苗的生产。其它细胞如口蹄疫对应BHK21细胞（幼仓鼠肾传代细胞），蓝耳病（猪繁殖与呼吸障碍综合症，PRRS）对应Marc-145 （绿猴肾细胞），流感病毒对应MDCK（马丁达比犬肾上皮细胞）。 

病毒接种及CPE 观察： 

①取已长成单层细胞的培养瓶二个，用无菌毛细滴管吸去瓶中液体。 

②用无菌的1 毫升吸管吸稀释的腺病毒液0.1 毫升加入一只单层细胞培养瓶中，另一只加0.1 毫升营养液不接种病毒作对照，细胞瓶平放，使其接触整个细胞层，置37 ℃使作用15~30 分钟。 

③取出单层细胞瓶，每只瓶中加入营养液0.9 毫升，盖紧后置37 ℃孵箱中培养1~2 天。 

④取出细胞在低倍显微镜下观察，注意有无出现CPE（细胞肿胀，变圆，集聚成葡萄串状等）。 

病毒感染测定 

TCID50实验：将待测病毒倍比稀释，接种于单层细胞，以感染50%组织细胞的最高稀释倍数为判定终点。 

病毒数量测定 

1.血凝实验 病毒悬液做不同倍数稀释，然后和红细胞凝集，以最高稀释倍数的结果作为病毒血凝效价。 

2 中和实验 抗病毒血清与病毒中和，来半定量检测病毒的量。

      有时候分离到的病毒并不会只有一种（如猪同时感染了两种亚型的流感病毒），这时候还需要通过蚀斑实验或者抗体中和接种等方式来纯化病毒。如果到最后还是没有分离到病毒，应考虑临床诊断和实验室诊断是不是出错了，病料采集是否正确，是否没有冷链运输，分离病毒用的细胞株是否恰当，以及是否碰上了未知病毒等等。

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