人多能干细胞研究  目录

类器官相关研究 目录

1.0 简介

胰腺是分解淀粉、蛋白质和脂肪，以及平衡体内葡萄糖的消化和内分泌器官。尽管过去几十年，对胰腺癌的研究非常普遍而且重要，胰腺外分泌腺组织的体外长期维持方法近期才被报导^{1, 2}。在该系统中，分离的胰腺导管在添加有适当的生长因子和细胞外基质的培养环境中，形成胰腺外分泌类器官。

类器官是自我组织形成的三维（3D）细胞培养物，包含所代表器官的一些细胞类型和关键特征。由于维持了干细胞和祖细胞的增殖能力，上皮类器官在培养物中维持培养远远优于离体原代细胞的培养。由于它们能在体外进行有效生长并与胰腺上皮细胞直接相关，可以使用胰腺外分泌类器官来补充或替代许多胰腺研究实验方法。与其他常见模型系统相比，类器官可来源于健康和特定疾病组织的细胞。从小鼠原代肿瘤和转移瘤中分离的组织可以构建出肿瘤源性的类器官，为胰腺癌和胰腺导管腺癌的研究提供模型³。这些类器官保留了肿瘤的关键特征，包括基因表型和细胞表型，这为体外实验提供了一个方便的模型系统。

PancreaCult™类器官生长培养基（小鼠）适用于来源于胰腺导管、导管小段、单个细胞或冻存的类器官的胰腺外分泌类器官的生长。胰腺类器官的可以通过长期传代或冷冻保存，为后续实验提供稳定的细胞来源。通常情况下，在原代培养物中，2天内便可观察到类器官，并且在约3-6天后可进行传代。生长在PancreaCult™类器官生长培养基（小鼠）中的胰腺外分泌类器官表达胰腺祖细胞（例如Pdx1，Axin2）和导管细胞（例如Krt19，Muc1）标志物。

PancreaCult™类器官生长培养基（小鼠）支持小鼠胰腺类器官两种方法培养， Matrigel®domes 培养方法，或稀释的Matrigel®悬浮培养方法。

2.0 试剂材料

2.1主要试剂

2.2 其它试剂和材料

*推荐使用蛋白含量大于 8 mg/mL的 Matrigel，低蛋白浓度可能影响类器官的生成。

3.0准备试剂和材料

3.1 胰腺类器管生长培养基

用无菌技术准备PancreaCult™类器官生长培养基(基础培养基+添加物+抗生素)。下面的例子是准备100 mL完全培养基。如果准备其它体积，进行相应调整。当使用单细胞进行初始培养或传代时，在完全的PancreaCult™类器官生长培养基中添加Y-27632使其终浓度为10 µM。

1) 2-8℃过夜解冻添加物，完全混匀。

注：一旦解冻，应立即使用或分装置于-20℃。不要超过保质期。分装的添加物再解冻后，应立即使用。切勿反复冻融。

2) 将5 mL添加物加入95 mL 基础培养基中。

3) 加入抗生素（例如50 g/mL庆大霉素）。完全混合。使用前升温至室温（15-25°C）。

注：如不立即使用，将PancreaCult™类器官生长培养基可在2-8℃存储，1个月内用完。

3.2 组织解离液

1) 用无菌技术准备30 mL组织解离液(足够解离一只小鼠的胰腺)：

- 3.75 mL胶原酶IV

- 3.75 mL Dispase分散酶

- 300 µL DNase I溶液（1 mg/mL）

- 22.2 mL DMEM/F-12+15 Mm HEPES

混合均匀。

注：如不立即使用，可在2-8℃存储，1个月内用完。

2) 使用前，升温至室温（15-25°C）。

3.3 润洗离心管和移液管

与胰腺组织接触的离心管和移液管需先润洗，因为胰腺组织经常粘附在上面，显著降低类器官产量。实验当天润洗离心管和移液管。

A  润洗离心管

对于每个要处理的胰腺，按照下面的方法润洗12支15 mL离心管和3支50 mL离心管。

1) 在15 mL离心管中加入5 mL抗粘附冲洗液，旋涂管子。

2) 将第一支离心管中的冲洗液倒入第二支15 mL离心管。重复以上操作，直到所有15 mL离心管都被冲洗液包被。

3) 从包被的离心管中吸去用过的抗黏附冲洗溶液。

4) 使用Advanced DMEM/F12代替抗黏附冲洗液重复步骤1-2。从已包被好的15 mL离心管中吸去任何残留的Advanced DMEM/F-12。

5) 根据步骤1-4，用30 mL防粘冲洗液和30 mL Advanced DMEM/F-12润洗1支50 mL离心管。

6) 使用之前，盖好管盖，将包被好的离心管储存于室温（15-25°C）。

B 润洗1支10 mL移液管

a. 在一支50 mL离心管中加入25 mL抗粘附冲洗液，在另一支50 mL离心管中加入25 mL Advanced DMEM/F-12。置于室温（15-25°C）。

b. 使用前，先用用抗粘附冲洗液包被移液管，随后再用Advanced DMEM/F-12包被移液管。

4.0 胰腺类器官的Matrigel dome培养

操作之前阅读整个操作流程。使用无菌技术进行以下操作。

4.1 以组织或类器官碎片培养

4.1.1新鲜胰腺组织原代类器官培养

以下方案用于从一只小鼠的胰腺导管片段来诱导胰腺祖细胞类器官，并以Matrigel dome培养。

A 建立类器官

1) 将2个24孔组织处理过的培养板置于37℃培养箱中孵育至少1小时。一盒200 µL的枪头置于2-8°C。

2) 冰上解冻450-500 µL Matrigel。

注：冰上解冻和处理MatrIgel防止其成胶。

3) 准备PancreaCult™类器官生长培养基和组织解离液（见3.1节和3.2节）。升温至室温（15-25°C）。

4) 在100 mm培养皿中加入30 mL15 mM HEPES+DMEM/F-12，共2个培养皿，置于冰上。将2支50 mL离心管也置于冰上。

B分离胰腺导管

5) 根据批准的操作指南处死小鼠。把小鼠置于冰上直到解剖。

6) 在处死2小时内，分离小鼠胰腺并将其转移到含有预冷的DMEM/F-12的培养皿中（见步骤4）。清洗培养皿中的胰腺。使用镊子将胰腺转移到含有预冷的DMEM/F-12的第二个培养皿中。将胰腺浸没在DMEM/F-12中，然后切成约3 mm的小块。

7) 使用25 mL的移液管，将胰腺碎片和DMEM/F-12一起转移到一支置于冰上的50 mL离心管中(见步骤4)。

8) 在冰上，胰腺碎片依靠自重下沉2分钟。吸去上清液。

9) 然后在离心管中加入5 mL室温（15-25℃）的解离液(见3.2节)。37℃水浴20分钟。

10) 将离心管从水浴锅中取出。用10 mL润洗的移液管，中等力量上下吹打胰腺碎片7次。

11) 使胰腺碎片依靠自重下沉1分钟。

12) 用10 mL的移液管吸去上清液(包含悬浮在上清液中的被消化成的细胞)。

注：消化上清液仅在第一次消化周期内被丢弃。在剩余的消化循环中，保留上清液。

13) 重复步骤9-11(第二个消化循环)。用10 mL的移液管收集上清液，并加入到一支新的预冷的50 mL离心管(见步骤4)中。置于冰上。

14) 重复步骤9-11共4次（第3-6个消化循环），每次消化后，将上清液收集到置于冰上的50 mL的离心管中(步骤13)。

注：每次成功的消化，胰腺导管都会释放在上清液中。来自于消化循环2-6的上清液共大约25 mL。

15) 将70 µm的细胞筛置于50 mL离心管上。用5 mL抗黏附缓冲液以及5 mLAdvanced DMEM/F-12依次润洗细胞筛。

16) 使用润洗的25 mL移液管，将合并的上清液（来自步骤14）通过细胞筛。扔掉滤液。

17) 翻转滤网将其置于一支新的润洗的50 mL离心管上。使用10 mL移液管，小心将依次将12 mL预冷的Advanced DMEM/F-12加入到可翻转滤网，共加2次，将组织碎片和导管冲洗到离心管中。

注：当整个底部表面被彻底冲洗时，确保移液管的尖端接触过滤器的表面。如果碎片仍然留在表面，使用移液管轻轻刮擦，并转移到离心管中。

18) 使用润洗的10 mL移液管，上下吹打胰腺导管(步骤17)3-5次形成均匀的悬浮液。立即在12支15 mL润洗离心管（见制备部分）中转移等体积胰腺导管悬浮液。

19) 290 x g离心12支离心管5分钟。尽可能多地吸去上清液而不扰动沉淀的导管，在每个试管中留下约5-10 µL悬液（细胞团经常看不到）。将离心管置于冰上。

C类器官形成

20) 从培养箱中取出第一个24孔培养板，从冰箱中取出200 µL的枪头，放在生物安全柜中。

21) 如下所述，一次处理一支离心管/细胞团。快速操作以确保Matrigel不凝固。

注：24孔板中心的8孔最适合dome培养，因为它们的表面是最平的。培养板边缘的培养孔通常有点倾斜，导致dome 会与培养孔的孔壁接触而变平。

a. 使用带有预冷的200 µL枪头的移液枪，在12支离心管（步骤19）中各加入35 µL解冻的Matrigel。上下吹打5-8次，轻轻混匀导管-Matrigel悬浮液，避免产生气泡。

b. 将移液枪体积设为50 µL。将1支离心管中的所有导管-Matrigel悬浮液加入24孔板中心的1个培养孔中形成一个dome。分配时，逐渐将移液枪向上移动，使导管分布均匀。分配时只加在移液枪的第一次停顿处，避免产生气泡。

22) 重复步骤21进行其它7个细胞团的接种。

23) 从培养箱中取出第二个24孔培养板，对剩下的4支离心管重复步骤21。

24) 盖好培养板，将培养板放入37℃和5%CO2的培养箱中孵育10分钟，使dome凝固。

25) 从培养箱中取出培养板，放在生物安全柜中。在不扰动dome的情况下，沿着培养孔壁，将750 µL室温(15-25℃)的PancreaCult™类器官生长培养基加入dome培养孔，不要将培养基直接加在dome上。

26) 将无菌的PBS添加到任何未使用的培养孔中。盖好培养板。

27) 使用明场显微镜2X镜观察图像(第0天图像)。37°C和5%CO2孵育。

注：为了监测类器官的生长，每2-3天拍摄一次相同视野的照片，直到它们传代。 

28) 在室温(15-25°C)下，每2-3天通过加入750 µL新鲜的PancreaCult™类器官生长培养基进行一次全换液，培养一周以上。

注：如果Matrigel dome松散，则从培养孔中移除250 µL培养基，然后添加500 µL的新鲜培养基。

注：为了避免周末换液，可在周一、周三和周五进行换液。

29) 每天监视类器官。在内腔变黑和塌陷之前，应该进行传代。这通常发生在第3-6天。

注：加入没有出现类器官或者仅有又小又少的类器官出现，进行4.1.2节1-9。290 x g离心12支离心管5分钟。尽可能多地吸去上清液而不扰动沉淀的导管，在每个试管中留下约5-10 µL悬液（细胞团经常看不到）。将离心管置于冰上。进行4.1.1节20-28。

4.1.2 胰腺外分泌类器官传代

以下流程用于通过碎片编号传代胰腺外分泌类器官以Matrigel dome方法培养。单细胞传代见4.2节，稀释的Matrigel悬浮培养见“小鼠胰腺类器官稀释的Matrigel悬浮培养”。

1) 24孔板置于37℃培养箱中至少1小时。200 µL无菌枪头置于2-8℃。

2) 冰上解冻Matrigel（传代1孔需要40 µL）。并将Advanced DMEM/F-12也置于冰上。

3) 准备PancreaCult™类器官生长培养基，并将其升温至室温（15-25°C）。

4) 检查要传代的Matrigel dome是否完整。如果dome完好，则进行步骤5。如果dome松散，加入预冷的Advanced DMEM/F-12，使每孔总体积增加至1 mL至少保持1分钟然后进行步骤7。

5) 在不接触dome的情况下，将每个培养孔中的培养基吸去并进行传代。

6) 使用1 mL移液枪，用力向每个dome中心添加1 mL预冷的Advanced DMEM/F-12，并静置1分钟。

7) 用 1 mL移液枪，用力上下吹打15次，避免产生气泡。

注：这种机械操作将导致类器官+Matrigel形成30-100 µm大小的碎片，显微镜下观察；如果大多数碎片大于100 µm，继续操作，直到直径都≤100 µm。

8) 如果传代多孔，将所有培养孔中的培养物混合在一支15 mL的离心管中。如果传代一孔，将该孔中的培养物加入15 mL离心管。

9) 将类器官碎片通过一个70 µm细胞筛，收集滤液。弃掉细胞筛。

10) 以中等速度轻轻涡旋含有器官碎片的离心管5秒。立即将3 个 10 µL碎片悬浮液转移到6孔板的培养孔中，形成3个单独的培养孔。将剩余的碎片悬浮液置于冰上。

11) 按以下方法，确定悬浮液中类器官碎片的平均数量：

a. 显微镜下计数每10 μL悬滴中的胰腺类器官碎片数量，并测定10 µL的平均数。仅计数30-100 µm大小的碎片。

注：如果碎片的密度太高而难以计数，则用Advanced DMEM/F-12稀释悬液。重复步骤9。

b. 计算传代200个碎片/孔所需的体积。对于每个新接种的Matrigel dome，将此体积添加到含有1 mL Advanced DMEM/F-12的15 mL离心管中。 例如：

- 3 x 10 µL碎片计数=35, 40, 42碎片

- 每10 µL悬液中的碎片大约39个。

- 接种200个碎片，就需要51 µL悬液。

12) 290 x g离心含有200个碎片(见步骤11b)的离心管5分钟。尽可能多的吸去上清液，而不扰动细胞团。在离心管内留下5-10 µL上清液。把离心管置于冰上。

13) 对于传代的后续步骤，请参阅4.1.1节步骤20-28。

注：每日监测胰腺祖细胞类器官。接种200个碎片的类器官通常需要每3-6天传代一次；在初始传代后，使用1：10到1：30的分配比例。

图1 以Matrigel Domes方式在 PancreaCult™类器官生长培养基中培养胰腺类器官

（A）大多数胰腺类器官直径仍小于100 μm，显示出清晰的管腔，此时尚不宜传代。（B）大多数类器官直径大于100 μm，其中一些类器官的管腔变暗。此时的培养物已经可以进行传代。（C）类器官已经超过最佳传代时间，大部分类器官的官腔变暗，许多类器官已经塌陷。

4.2单细胞培养

4.2.1解离原代胰腺组织为单细胞

1) 准备 PancreaCult™类器官生长培养基。本流程中需在 PancreaCult™类器官生长培养基中加入Y-27632使其终浓度达到10 µM。（见3.1节）

2) 准备DNase I + TrypLE™溶液（见3.3节）。

3) 如4.1.1节步骤1-14所述，用单个小鼠胰腺分离胰腺导管。以下操作用于处理1/4收获的胰腺组织，在4.1.1节步骤14时将悬液合并。

4) 290 x g离心5分钟。尽可能多的吸去上清，而不扰动沉淀物，在管中留下约5-10 µL液体。

5) 在沉淀物中加入1 mL DNaseⅠ+TrypLE™溶液。用润洗的10 mL移液管，轻轻上下吹打5-10次重悬细胞团。加入另外的DNaseⅠ+TrypLE™溶液，使总体积为4 mL。置于37℃，水浴10分钟将收集的组织碎片消化成单细胞。

6) 使用润洗的5 mL移液管，上下吹打悬液5次。在试管中加入8 mL Adanced DMEM/F-12。

7) 290 x g离心5分钟。尽可能多的吸去上清，而不扰动沉淀物，在管中留约5-10 µL上清液。

8) 使用润洗的10 mL移液管，在试管中加入5 mL Adanced DMEM/F-12上下吹打5次重悬细胞团。

9) 将细胞悬液通过一个置于15 mL离心管的37 µm的可翻转滤网，收集滤液。用2.5 mL Adanced DMEM/F-12清洗含有悬液的离心管，然后再将悬液通过滤网，并再次收集滤液。弃去滤网。

10) 进行细胞计数，评估悬液中细胞数量。

11) 在润洗的5支离心管中，每支加入5000个细胞，每支离心管中预先添加了1 mLAdanced DMEM/F-12。仔细稀释细胞很重要，不要过度接种。

12) 290 x g离心5分钟。在不扰动细胞团的情况下，尽可能多的吸去上清液，离心管中留下约5-10 µL上清液并将其置于冰上。

13) 按照4.1.1节步骤20-29以Matrigel-dome培养，或以稀释的Matrigel悬浮培养(见“小鼠胰腺类器官稀释的Matrigel悬浮培养”）接种胰腺祖细胞。

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