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HepatiCult™类器官生长培养基（货号#06030）（小鼠）是一种无血清的培养基，可以从小鼠肝脏组织快速生成肝祖细胞类器官。起始样本可来源于肝管、肝管小段、单个细胞或冷冻保存的类器官，并在Corning® Matrigel®液滴（domes）中培养，或在含有稀释的Matrigel®培养基中进行悬浮培养（suspension）。

1.0 试剂和材料的制备   

1.1 肝类器生长培养基

用无菌技术制备Hepaticult™肝类器官生长培养基(基础培养基+添加物+抗生素)。下面的例子是制备100 mL的完全培养基。如果制备其它体积，进行相应调整。当使用单细胞进行初始培养或传代时，在完全的HepatiCult™类器官生长培养基中添加Y-27632使其终浓度为10 µM。

1) 2-8℃过夜解冻添加物，完全混匀。

注：一旦解冻，应立即使用或分装置于-20℃。不要超过保质期。分装的添加物再解冻后，应立即使用。切勿反复冻融。

2) 将5 mL添加物加入95 mL 基础培养基中。

3) 加入抗生素（例如50克/mL庆大霉素）。完全混合。使用前加热至室温（15-25°C）。

注：如不立即使用，将Hepaticult™类器官生长培养基存放于2-8°C最多一个月。

1.2 组织解离混合物

1) 用无菌技术制备60 mL组织解离混合物(足够解离一只小鼠的肝脏)：

- 7.5 mL胶原酶IV

- 7.5 mL Dispase分散酶

- 45 mL DMEM/F-12+15 Mm HEPES

混合完全。

注：如不立即使用，可在2-8℃最多存储1个月。

2) 使用前，预热至室温（15-25°C）。

1.3 单细胞解离试剂

在5 mL Tryplle™酶中加入50 µL1 mg/mL DNase I溶液制备DNase I+Tryplle™溶液。充分混合并置于在冰上。

1.4 预湿离心管和移液管

与肝导管接触的离心管和移液管需先预湿，因为肝导管经常粘附在上面，显著降低类器官产量。实验当天预湿离心管和移液管。

对于每个要处理的肝脏，预湿4支15 mL离心管和1支50 mL离心管。

1) 在15 mL离心管中加入5 mL抗粘附冲洗液，旋涂管子。

2) 将第一支离心管中的冲洗液导入第二支15 mL离心管。重复以上操作，直到所有15 mL离心管都被冲洗液包被。弃去使用过的冲洗溶液。

3) 从包被的离心管中吸去任何剩余的冲洗溶液。

4) 使用Advanced DMEM/F12重复步骤1-2用以去除残留的冲洗液。从已经包被的15 mL离心管中吸去任何剩余的Advanced DMEM/F-12。

5) 根据步骤1-4，用30 mL防粘冲洗液和30 mL Advanced DMEM/F-12预湿1支50 mL离心管。

6) 使用之前，将包被好的管子储存于室温（15-25°C）条件下。

如下，预湿1支10 mL移液管：

a. 15 mL离心管加入10 mL抗粘附冲洗液，在第二个15 mL离心管中加入10 mL Advanced DMEM/F-12。置于室温（15-25°C）。

b. 在接下来的2.1.1节第20步使用前，用抗粘附冲洗液包被移液管，然后再用Advanced DMEM/F-12。

2.0 肝类器官的Matrigel dome培养方式

操作之前阅读整个操作流程。使用无菌技术进行以下操作：建立类器官和传代小鼠肝祖细胞类器官

2.1 以组织或类器官碎片培养

2.1.1新鲜肝组织原代类器官培养

以下方案用于从一只小鼠的肝导管片段来诱发肝祖细胞类器官，并以Matrigel dome培养。

A 建立类器官

1)将24孔组织处理过的培养板放置在37℃培养箱中孵育至少1小时。一盒200 µL的枪头置于2-8°C。

2)冰上解冻150-200 µLCorning Matrigel。

注：冰上解冻和处理MatrIgel防止其成胶。

3)制备Hepaticult™类器官生长培养基和组织解离混合物（见1.1节和1.2节）。加热至室温（15-25°C）。

4)在100 mm培养皿中加入30 mL15 mM HEPES+DMEM/F-12，共2个培养皿，置于冰上。将2支50 mL离心管也置于冰上。

B 分离肝导管碎片

5)根据批准的操作指南处死小鼠。把小鼠置于冰上直到处死。

6)在处理后2小时内，分离小鼠肝脏并将其转移到含有预冷的DMEM/F-12的培养皿中（见步骤4）。

7)涡旋清洗培养皿中的肝脏。使用镊子将肝脏转移到含有预冷的DMEM/F-12的第二个培养皿中。

8)将肝脏浸没在DMEM/F-12中，然后切成3-5 mm的小块。

9)使用25 mL的移液管，将肝脏碎片和DMEM/F-12一起转移到一支置于冰上的50 mL离心管中(见步骤4)。

10)在冰上，肝脏碎片依靠自重下沉2分钟。吸去上清液。

11)然后在离心管中加入10 mL室温的解离混合物(见1.2节)。37℃水浴20分钟。

12)将离心管从水浴锅中取出。用10 mL移液管，中等力量上下吹打肝脏碎片7次。

13)肝脏碎片在重力作用下下沉1分钟。

14)用10 mL的移液管吸去上清液(包括悬浮在上清液中的被消化细胞)。

注：消化上清液仅在第一次消化周期内被丢弃。在剩余的消化循环中，保留上清液。

15)重复步骤11-13(第二个消化循环)。用10 mL的移液管收集上清液，并加入到一支新的预冷的50 mL离心管(见步骤4)中。置于冰上。

16)重复步骤11-13，每次消化后，将上清液收集到置于冰上的50 mL的离心管中(步骤15)。继续重复这些步骤，直到肝脏碎片被分解成肝管，而看不见肝脏碎片的残留。这通常需要6 x 20分钟的消化循环。第1-6个消化循环的混合上清液体积约为50 mL。

17)将70 µm的细胞筛置于50 mL离心管上。使用25 mL的移液管，将合并的上清液（来自步骤16）通过细胞筛。扔掉细胞筛。

18)将一个新的37 µm的可翻转滤网置于新的50 mL离心管上。使用25 mL移液管，将来自步骤17的滤液通过滤网。扔掉过滤后收集的滤液。

19)将滤网翻转倒置在预湿的50 mL离心管上(见3.4节)。用10 mL的移液管，小心地将10-12 mL预冷(2-8℃)的DMEM/F-12加入到反转滤网中，冲洗肝导管并过滤到预湿的离心管中。

注：当整个底部表面被彻底冲洗时，确保移液管的尖端接触过滤器的表面。如果碎片仍然留在表面，使用移液管轻轻刮擦，并转移到离心管中。

20)使用预湿的10 mL移液管，上下吹打肝脏导管(步骤19中收集)3-5次形成均匀的悬浮液。立即在4支15 mL预湿离心管（见制备部分）中转移等体积肝脏导管悬浮液。

21)290xg离心4支离心管5分钟。尽可能多地吸去上清液而不扰动沉淀的导管，在每个试管中留下约5-10 µL悬液（细胞团经常看不到）。将离心管置于冰上。

C类器官形成

22)从培养箱中取出24孔培养板，从冰箱中取出200 µL的枪头，放在生物安全柜中。

23)如下所述，一次处理一支离心管/细胞团。快速操作以确保Matrigel不凝固。 

注：24孔板中心的8孔最适合dome培养，因为它们的表面是最平的。培养板边缘的培养孔通常有点倾斜，导致dome 会与培养孔的孔壁接触而变平。

a.使用带有预冷的200 µL枪头的移液枪，将30 µL解冻的Matrigel加入细胞团。上下吹打5-8次，轻轻混匀导管-Matrigel悬浮液，避免产生气泡。

b.将移液枪体积设为50 µL。在24孔板中心的1个培养孔中加满悬浮液，形成一个dome。分配时，逐渐将移液枪向上移动，使导管分布均匀。避免在dome上产生气泡。 

24)对剩下的细胞团重复步骤23。

25)盖好培养板，将培养板放入37℃和5%CO₂的培养箱中孵育10分钟，使dome凝固。

26)从培养箱中取出培养板，放在生物安全柜中。

27)在不干扰dome的情况下，沿着培养孔壁，将750 µL室温(15-25℃)的HepatiCult™肝类器官生长培养加入dome培养孔，不要将培养基直接加到dome上。

28)将无菌的PBS添加到任何未使用的培养孔中。盖好培养板。

29)使用明场显微镜2X镜观察下图像(第0天图像)。37°C和5%CO₂孵育。

注：为了监测类器官的生长，每2-3天拍摄一次相同视野的照片，直到它们传代。 

30)培养一周以上时，每2-3天在室温(15-25°C)下加入750 µL新鲜的HepatiCult™肝类器官生长培养基进行一次换液。

注：如果Matrigel dome松散，则从培养孔中移除250 µL培养基，然后添加500 µL的新鲜培养基。 

注：为了避免周末换液，可在周一、周三和周五进行换液。

31) 每天监视类器官。在内腔变黑和塌陷之前，应该进行传代。在早期传代中，这通常发生在第4-6天，在后来的传代中，发生在第6-7天。类器官传代见2.1.2节。

2.1.2类器官传代

以下流程用于通过碎片编号传代肝祖细胞类器官，然后在Matrigel®dome中培养。单细胞传代（4.2节）和稀释的Matrigel悬浮培养（3.0节）。

1)24孔板置于37℃培养箱中至少1小时。200 µL无菌枪头置于2-8℃。

2)冰上解冻Matrigel（传代1孔需要40 µL）。并将Advanced DMEM/F-12也置于冰上。

3)准备HepatiCult™肝类器官生长培养基，并将其加热至室温（15-25°C）。

4)检查要传代的Matrigel dome是否完整。如果dome完好，则进行步骤5。如果dome松散，加入预冷的Advanced DMEM/F-12，使每孔总体积增加至1 mL至少保持1分钟然后进行步骤7。

5)在不接触dome的情况下，将每个培养孔中的培养基吸去并进行传代。

6)使用1 mL移液枪，用力向每个dome中心添加1 mL预冷的Advanced DMEM/F-12，并静置1分钟。

7)用 1 mL移液枪，用力上下吹打15次，避免产生气泡。

注：这种机械操作将导致类器官+Matrigel形成30-100 µm大小的碎片，显微镜下观察；如果大多数碎片大于100 µm，继续操作，直到直径都≤100 µm。

8)将所有培养孔中的培养物混合在一支15 mL的离心管中。

9)以中等速度轻轻涡旋含有器官碎片的离心管5秒。立即将3 x 10µL碎片悬浮液转移到6孔板的培养孔中，形成3个单独的培养孔。将剩余的碎片悬浮液置于冰上。

10)按以下方法，确定悬浮液中类器官碎片的平均数量：

a.显微镜计数每10 μL悬液中的肝类器官碎片数量，并测定10 µL的平均数。仅计数30-100 µm大小的碎片。

注：如果碎片的密度太高而难以计数，则用Advanced DMEM/F-12稀释悬液。重复步骤9。

b.计算传代200个碎片/孔所需的体积。对于每个新接种的Matrigel dome，将此体积添加到含有1 mL Advanced DMEM/F-12的15 mL离心管中。 例如：

- 3 x 10 µL碎片计数=35, 40, 42碎片

- 每10 µL悬液中的碎片大约39个。

- 接种200个碎片，就需要51 µL悬液。

11)290 x g离心含有200个碎片(见步骤10b)的离心管5分钟。尽可能多的吸去上清液，而不扰动细胞团。在离心管内留下5-10 µL上清液。把离心管置于冰上。

12)对于传代的后续步骤，请参阅4.1.1节步骤22-30。

注：每日监测肝祖细胞类器官。接种200个碎片的类器官通常需要每4-7天传代一次；在初始传代后，使用1：10到1：30的分配比例。

图1 以Matrigel Domes方式在 HepatiCult™肝类器官样生长培养基中培养肝类器官

（A）大多数肝类器官直径仍小于100μm，显示出清晰的管腔，尚未准备好传代。（B）大多数类器官直径大于100 μm，其中一些类器官的管腔变暗。这些培养物已经可以传代了。（C）类器官已经通过传代，大部分类器官的官腔变暗，许多类器官已经塌陷。

2.2 以单细胞培养

2.2.1解离原代肝组织为单细胞

1)如2.1.1节步骤1-19所述，用单个小鼠肝脏分离肝导管。省略步骤17以尽可能多的收获组织，并按照2.11节步骤18-19，通过用Adanced DMEM/F-12洗脱37 µm可翻转滤网，收集肝导管到预湿的50 mL离心管中。

2)290 x g离心5分钟。尽可能多的吸去上清，而不扰动沉淀物，在管中留下约5-10 µL液体。

3)用预湿的10 mL移液管，在沉淀物中加入4 mL DNaseⅠ+Tryplle™溶液。轻轻上下吹打5-10次重悬细胞团。置于37℃水浴10分钟将收集的导管分离成单细胞。

4)在试管中加入8 mL Adanced DMEM/F-12。将总体积通过一个预先湿润的37 µm的滤网，并收集滤液。

5)290 x g离心5分钟。尽可能多的吸去上清，而不扰动沉淀物，在管中留约5-10 µL上清液。

6)用1 mL Adanced DMEM/F-12重悬细胞。

7)加入4 mL氯化铵裂解液裂解红细胞。轻轻上下吹打5-10次混匀。将等体积的此悬浮液转移到8个预湿润的15 mL离心管，每根管子做好标记。将离心管置于冰上5分钟来裂解红细胞。

8)290 x g离心8根管子5分钟。在不扰动细胞团的情况下，尽可能多的吸去上清液，离心管中留下约5-10 µL上清液并将其置于冰上。

9)将细胞接种于24孔板的中间8孔中，按照2.1.1节步骤22-31以Matrigel-dome培养，或步骤3.1节步骤6-15以稀释的Matrigel悬浮培养(见下文)。

2.2.2 解离类器官成单细胞

1)按照2.1.2节步骤1-8操作Matrigel domes。

2)290 × g离心含肝细胞碎片的离心管5分钟。尽可能多的吸去上清，而不扰动细胞团，离心管中留下5-10 µL上清液并将其置于冰上。

3)向细胞团中加入1 mL DNaseI+Tryplle™（见1.3.节），并轻轻吹打5-10次，避免产生气泡。37℃水浴10分钟使类器官解离为单细胞。

4)离心管中加入2 mL Adanced DMEM/F-12。

5)290 × g离心5分钟。吸去尽可能多的上清液，而不扰动细胞团，离心管中留下约5-10 µL上清液。

6)离心管中加入1 mL Adanced DMEM/F-12。用血球计数板进行细胞计数，计算细胞悬液中细胞数量。

7)每孔添加10,000-15,000个细胞，接种到相应的15 mL离心管中，每个离心管含有1 mL预冷的Advanced DMEM/F-12。小心分配细胞，切勿过度接种。

注：为了取得最佳效果，建议在接种肝导管碎片时，将从来自一个肝脏的肝导管接种在4个培养孔中(每孔30 µL Matrigel dome)，如果是单细胞接种则接种在8孔中。一旦建立了类器官(P1)，每30 µL Matrigel dome接种200个类器官碎片或10000-15000单细胞。这是至关重要的，不要过度接种。如果大量的起始材料嵌入在Matrigel中，类器官就不能正常扩增，结构稳定性也会受到损害。

8)290 × g离心5分钟。尽可能多的吸去上清液，而不扰动细胞团，离心管中大约留下5-10 µL上清液。将离心管置于冰上。

注：细胞团经常看不到。

9)有关传代的后续步骤，参照2.1.1节22-31。

3.0肝类器官稀释的Matrigel悬浮培养方式

除了能以Matrigel® dome的方式培养外，类器官还可以稀释的Matrigel悬浮方式培养。当采用悬浮培养方式时，Matrigel形成类似于“云”状半固体，一种松散胶囊状类器官。相比Matrigel dome培养方式，悬浮培养方式扩大了培养的规模。这种大量的培养，可能是由于减少了培养基的更换次数，降低了对Matrigel 物理稳定性的依赖，该培养技术更适合高通量培养。与 Matrigel dome 方式培养的类器官相比，稀释的Matrigel悬浮方式培养的类器官通常在较早的时间内就能传代，通常在3-6天内，并可通过传代进行维持培养，或者冻存起来，未以后实验做准备。

3.1 肝类器官的建立

1)将包装好的12孔板置于2-8°C下悬浮培养至少10分钟。将无菌1000 µL和200 µL枪头置于2-8°C。

2)冰上融化500-1000 µL Matrigel。

3)制备完全的HepatiCult™肝类器官生长培养基并置于冰上（见1.1节）。

4)准备组织解离混合物（见1.2节）。预热至室温（15-25℃）。

5)如2.1.1节步骤4-21所述将小鼠肝组织加工成导管碎片，或按照2.2.1节将原代肝组织分离成单细胞。

6)使用预冷的枪头，在添加了900 µL预冷HepatiCult™肝类器官生长培养基的15 mL离心管中加入100 µL解冻的Matrigel用以接种1个培养孔（如果接种10孔，离心管应该包含9 mL的HepatiCult™肝类器官生长培养基+1 mL Matrigel）。充分混合并置于冰上。

7)将冷却的12孔板置于冰上，并将950 µL Matrigel®+Hepaticult™肝类器官生长培养基的混合物添加到每个孔中进行接种。

8)如下所述，一次处理一个来自2.1.1节步骤21的离心管/细胞团。将Matrigel添加到细胞团，快速操作，以确保Matrigel不凝固。

9)使用带有预冷的200 µL枪头的移液枪，在细胞团顶部加入50 µL Matrigel+Hepaticult™肝类器官生长培养基的混合物（见步骤6）。

10)上下吹打5-8次，轻轻混匀，避免产生气泡。

11)将整个悬浮液转移至含有950 µL Matrigel+Hepaticult™肝类器官生长培养基的混合物的12孔板的1个孔中（见步骤7）。轻轻搅拌培养板混合培养物。

12)对于其余试管重复步骤9-11，将50 µLMatrigel+Hepaticult™肝类器官生长培养基的细胞悬液加入已经含有950 µL Matrigel+Hepaticult™肝类器官生长培养基的混合物的新培养孔中。

13)盖好培养板，并将培养板置于5%CO₂、37°C培养箱中的定轨摇床上，转速设置为80 rpm。

14)接种后10分钟，显微镜2X镜观察图像(第0天图像)。然后将培养皿小心放回培养箱。

注：一旦培养物被放置在了37°C的定轨摇床上，那么每个培养孔中的Matrigel通常会形成一个半固态的“云”，将碎片封在其中。

15)每隔一天或在所需的时间点拍摄培养孔的照片，以监测类器官的生长，直到它们传代。期间无需更换培养基。

3.2肝类器官传代

1.将12孔板在2-8℃条件下悬浮培养至少10分钟。将无菌1000 µL和200 µL枪头置于2-8℃条件下。

2.在冰上解冻Matrigel（约110 µL/孔，用于接种）。

3.制备完整的HepatiCult™肝类器官生长培养基。置于冰上。

4.使用1000 µL移液枪，粗略估计每个培养孔中培养物的体积，将移液伸入该体积，并大力上下吹打混匀30次，尽量减少气泡的产生。

注：这会导致肝脏类器官和Matrigel被机械地分解成30-100 µm的较小碎片。用光显微镜检查碎片大小；如果大部分碎片大于100 µm，继续吹打直到它们都变成≤100 µm。

注：扩增的类器官在传代过程中被机械粉碎，所产生的类器官碎片应小于100 µm(图3A)。如果大部分碎片大于100 µm (图3B)，继续粉碎碎片。在计算用于接种的类器官碎片时，只计算小于100 µm的碎片。注意不要计数单个细胞(图3C)。

图2 以稀释的Matrigel悬液方式在 HepatiCult™ 类器官样生长培养基中培养类器官

（A）大多数肝类器官直径仍小于100μm，显示出清晰的管腔，尚未准备好传代。（B）大多数类器官直径大于100 μm，其中一些类器官的管腔变暗。这些培养物已经可以传代了。（C）类器官已经通过传代，大部分类器官的官腔变暗，许多类器官已经塌陷。

图3 肝类器官以100 μm的碎片进行传代

（A）在传代过程中，类器官的机械破碎应产生直径在30-100 μm之间的碎片。 （B）大于100 µm的类器官碎片吗应该继续被破碎，直至其直径均为为30-100 µm。(C)在破碎期间，计数30-100 µm碎片(圆圈)并忽略单个细胞

5. 如果传代多个培养孔，将所有培养孔的内容物合并在一个15 mL的离心管中。如果传代单个培养孔，将整个培养孔的体积转移到一个15 mL的离心管中。

6. 要准备用于接种的类细胞器碎片，请参阅上述2.1.1节步骤9-11。要准备用于接种的单细胞，请参阅上面的步骤2.2.2节步骤2-8。

7. 有关传代的后续步骤，请参阅步骤3.1节步骤6-15。

注：每日监测肝祖细胞类器官。带有200个碎片的类器官通常需要每隔3-6天传代一次；初始传代后，在后续传代中使用1：10到1：30的比例进行分配。 

4.0 小鼠肝类器官冻存和复苏

4.1冻存

1)将 Advanced DMEM/F-12和CryoStor® CS10置于冰上，放入生物安全柜。

2)使用前标记2.0 mL冻存管，使用前将冻存管置于冰上，放入生物安全柜。

3)若要制备用于冷冻保存的器官碎片，请参阅2.1.1节步骤4-10。使用步骤2.1.1节步骤10中的方法，计算冻存800个类细胞器碎片/冻存管所需的类器官碎片悬液总体积。把这个总体积添加到一个含有1 mL Advanced DMEM/F-12的15 mL离心管中。

4)290 × g离心5分钟。尽可能多的吸去上清液而扰动细胞团，留5-10 µL上清液在离心管中(细胞团通常不可见)。将离心管置于冰上。

5)未盖住的2.0 mL冻存管置于冰上。

6)在1 mL预冷的CryoStor CS 10中，轻轻地重新细胞团5-8次。

7)将另外的1 mL预冷的CryoStor CS10添加到每根冻存管中。轻轻上下吹打5-8次，混匀。

8)使用1000µL移液枪，将“1 mL”这种CryoStor/片段悬浮液转移至标记并冷却的2.0 mL的冻存管中，转移前将总体积在离心管中混匀1-2次，以确保碎片均匀分布，然后再进行转移 。

9)立即盖上冻存管盖，并将所有含有碎片的冻存管转移到可控制速率的细胞冷冻容器中。将细胞冷冻容器放置在-80°C的条件下。

10)将细胞冻存盒置于-80℃冰箱24-48小时后，将细胞冻存管转移至液氮（-135℃）中进行长期的储存。

注： 操作迅速，尽量缩短未冻存的类器官与CryoStor® CS10的接触时间。

4.2 复苏

注：用抗粘附冲洗液预湿任何枪头或离心管至关重要，这样操作可以尽量减少类器官碎片在塑料器皿上的黏附。

1)从液氮中取出类器官冻存管，立即将冻存管放入37°C水浴中。

2)密切观察解冻过程，并在器官碎片完全解冻前从水浴锅中取出冻存管。

注：解冻过程不应超过1分钟。

3)使用2 mL血清学移液管，用2 mL DMEM/F-12+15 mM HEPES仔细清洗类器官碎片，使类器官碎片悬浮液完全解冻。

4)将清洗后的类器官碎片转移到15 mL离心管中。290 × g离心5分钟。

5)小心弃去上清液，用2 mL DMEM/F-12+ 15 mM HEPES重悬类器官碎片。

注：切勿一直吹打，避免将碎片吹打成单细胞悬液。. 

6)将类器官碎片悬液分装在15 mL离心管中，以便每支离心管都包含预期要嵌入的类器官碎片数量。我们推荐嵌入250个左右碎片。

注：接种高密度的碎片要比接种地密度碎片较早传代。

7)290 x g离心5分钟。尽可能多的弃去上清液。

8)执行2.1节类器官碎片嵌入和维持培养。

9)嵌入后每天评估类器官，以确定是否需要传代。复苏后的类器官比未被冻存过的类器官显得小。类器官变暗说明已经可以传代了。通常，这将发生再嵌入后4-6天。

10)在传代先前冻存过的类器官后，根据类器官密度、大小和形态，传代时间将恢复到每6-7天一次（见2.2.1节)。

附录

附录1 主要试剂

附录2 其它试剂和材料

*推荐使用蛋白含量大于 8 mg/mL的Corning Matrigel，低蛋白浓度可能影响类器官的生成。

附录3 设备

• 生物安全柜

• CO₂ 培养箱
  

• 低速离心机
  

• 吸管
  

• 台式离心机
  

• 移液器
  

• 血细胞计数器
  

• 倒置显微镜
  

• 异丙醇冻存盒
  

• -150℃冷冻设备或液氮罐
  

• 冰箱
  

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